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恐懼和焦慮是不同的適應性反應，對生存至關重要。恐懼是由離散且確定的威脅刺激引發的，而焦慮則源於對潛在威脅的預期。杏仁核中央核（CeA）對於離散條件化恐懼反應的獲得和表達至關重要，其在僵硬行為中的特定神經元亞群的作用也已得到充分證實。以往的研究強調了終紋床核（BNST）在應對不可預測或持續時間較長的威脅時的防禦反應中的作用。然而，與不可預測威脅處理和病理性焦慮相關的神經環路仍然知之甚少。

在此，作者通過使用改良的可預測CS（CS⁺）或不可預測CS（CS⁻）動物模型，發現島葉皮層對vBNST的興奮性輸入和杏仁核側核（CeL）對vBNST的抑製性輸入協同作用，觸發vBNST中GABA能神經元對不可預測而非可預測威脅信號的選擇性激活。作者進一步發現，vBNST中的GABA能神經元通過投射到杏仁核中央核（CeM）和腹側導水管周圍灰質（vlPAG）分別調節焦慮樣行為和僵硬行為。

1.vBNST中特定的GABA能神經元群體調節對不可預測威脅的反應

為了確定vBNST在應對不可預測威脅時的神經元變化，小鼠接受了改良的恐懼條件反射（FC）任務訓練。CS+和CS-信號均能引發小鼠的凍結行為（圖1A和1B）。晚期FC試驗中對CS-的神經反應顯著強於適應期和早期FC試驗（圖1B-1E）。在CS測試實驗中，vBNST神經元的Ca2+信號在CS-測試期間選擇性增加，而在CS+測試期間沒有變化（圖1F和1G）。vBNST中Vgat神經元的Ca2+信號在CS-測試期間顯著升高（圖1H-1L）。作者的結果表明vBNST中的GABA能神經元在應對不可預測威脅信號時被選擇性激活。並且研究了vBNST GABA能神經元在應對不可預測威脅時的防禦行為中的作用。在CS測試期間人工抑製vBNST中的GABA能神經元，對CS-的凍結行為減少，而對CS+的凍結行為正常（圖2D和2E）。在沒有CS回憶的新環境中人工激活了vBNST中的CS-反應性神經元群體，發現ChR2-mCherry組的凍結行為增加（圖2M）。這些發現表明vBNST中不同的GABA能神經元分別調控凍結和攝食行為。

圖1. 皮層-腦幹緩慢呼吸環路的鑒別

圖2. vBNST中的GABA能神經元調節對不可預測威脅的反應

2. 激活IC-vBNST回路對應對不可預測威脅至關重要

IC（島葉皮層）、CeL（中央杏仁核外側部）和CeM（中央杏仁核內側部）顯示出另外向vBNST CS-反應性細胞的投射，而vBNST攝食反應性細胞則接收另外來自vCA1（腹側海馬CA1區）、ZI（未定帶）、PAG（導水管周圍灰質）和NTS（孤束核）的投射。IC引起了作者的興趣，因為它在恐懼記憶回憶期間被激活，並且在焦慮障礙中報告了性能改變。作者發現，投射到vBNST的IC神經元在CS+和CS-測試期間均表現出激活增加（圖3C和3D）。通過全細胞記錄驗證了從IC到vBNST的單突觸興奮性連接的存在。電流鉗記錄顯示，藍光脈沖在感染AAV-ChR2(H134R)-EYFP的IC神經元中誘導了時間鎖定的動作電位發放（圖3E和3F）。短暫的光刺激vBNST中含有ChR2的IC末端，當膜電壓保持在-70 mV時，在GABA能神經元中誘發了興奮性突觸後電流（eEPSCs）。這些eEPSCs被浴液中的河豚毒素（TTX）消除，並可以通過應用鉀通道阻滯劑4-氨基吡啶（4-AP）恢復。此外，eEPSCs可以被AMPAR拮抗劑NBQX消除（圖3G和3H）。

光遺傳學抑製IC-vBNST回路可以減少對CS-測試的凍結水平，但對CS+測試沒有影響（圖3I-3K）。因此，作者的結果證實，IC中的谷氨酸能神經元與vBNST中的GABA能神經元建立了單突觸連接，並且這些投射到vBNST的IC神經元在應對可預測或不可預測威脅信號時表現出高活性。

圖3. IC的興奮性投射到vBNST調節對不可預測威脅信號的反應

3. CeL SOM⁺神經元的前饋抑製控製vBNST對不可預測威脅的反應

在CS⁺測試期間，vBNST可能通過其他傳入神經元的前饋抑製進行調控。逆行示蹤結果顯示，CeL向vBNST中對CS⁻反應的細胞群發送投射。因此，作者推測在CS⁺測試期間，CeL可能對vBNST施加前饋抑製。作者針對投射到vBNST的CeL神經元，通過體內纖維光度法記錄其Ca²⁺信號（圖4A和4B）。投射到vBNST的CeL神經元的Ca²⁺信號僅在CS⁺測試中升高（圖4C和4D）。

生長抑素（SOM）和蛋白激酶Cδ（PKCd）神經元是CeL中兩種重要的GABA能抑製性神經元，它們大部分不重叠，代表性能不同的神經元。接下來，作者發現抑製CeLSOM-vBNST投射對CS⁺或CS⁻測試均無影響（圖4G-4I）。人工激活CeLSOM-vBNST投射在未經過訓練的小鼠中無法誘發僵硬行為，並且降低了對CS⁻的僵硬水平，但對CS⁺測試沒有影響（圖4J-4M）。激活CeLSOM-vlPAG投射可以在未經過訓練的小鼠中誘發僵硬行為。抑製CeLSOM-vlPAG投射會損害CS⁺測試中的僵硬行為（圖S5）。因此，CeL中特定的SOM⁺神經元亞群在CS⁺測試期間對vBNST施加前饋抑製。

圖4. BNST投射的細胞神經元通過抑製性突觸傳遞控製vBNST對不可預測威脅的反應

4. vBNST-vlPAG和vBNST-CeM環路分別調控僵硬行為和焦慮樣行為

vBNST中對不可預測威脅反應的神經元群激活會導致焦慮樣行為，然而這些神經元群的下遊效應尚不清楚。為了探究這一問題，作者進行了活動依賴性神經元順行示蹤實驗，追蹤vBNST中對條件刺激（CS⁻）反應的細胞和進食反應的細胞的輸出。發現vBNST中CS⁻反應性細胞更傾向於向CeM、vlPAG和VTA發送投射，而vBNST中進食反應性細胞更傾向於向PVN、LH和NTS發送投射。作者通過光遺傳學方法發現，人工激活vBNST中CS⁻反應性神經元群的下遊靶點（vlPAG）可以誘導小鼠在新環境中或在旷場實驗（OFT）中增加僵硬行為，而激活CeM則沒有這種效果。相反，激活從vBNST中CS⁻反應性細胞到CeM的投射可以誘導焦慮樣行為。激活vBNST中CS⁻反應性神經元群到CeM的信號通路對OFT中的總行進距離沒有影響，這表明從vBNST中CS⁻反應性神經元群到CeM的環路可能有助於焦慮樣行為，但與運動無關。因此，vBNST中CS⁻反應性神經元群通過不同的輸出在應對不可預測威脅信號時發揮不同行為的作用。詳細來說，vBNST-vlPAG環路有助於僵硬行為，而vBNST-CeM環路有助於焦慮樣行為。

圖5. vBNST中對CS⁻反應的神經元分別投射到腹側導水管周圍灰質和中央杏仁核，分別調節僵硬行為和焦慮樣行為

5. 針對vBNST環路的調控為焦慮癥治療供應了潛在方向

vBNST中CS⁻反應性神經元群在不可預測威脅誘導的焦慮中的生理作用尚不清楚。為了研究這一問題，作者在慢性不可預測應激（CUS）處理後記錄了CS⁻反應性神經元群的活動。CUS組小鼠在旷場實驗（OFT）和高架十字迷宮（EPM）測試中表現出更高的焦慮樣行為（圖S7E和S7F）。為了進一步研究vBNST中CS⁻反應性神經元群在焦慮樣行為中的作用，作者進行了光遺傳學實驗。研究結果表明，抑製vBNST中CS⁻反應性神經元群可以緩解CUS處理小鼠的焦慮樣行為（圖S7G-S7I）。

此外，作者發現抑製vBNST-CeM環路可以改善在OFT和EPM測試中觀察到的高焦慮樣行為（圖S7J-S7L）。因此，vBNST中CS⁻反應性神經元群的過度激活通過投射到CeM促進了CUS誘導的焦慮，而靶向vBNST中CS⁻誘導的神經元群可能是緩解焦慮行為的潛在策略。

6. KCNQ3是通過穩定vBNST活動來治療不可預測應激誘導焦慮的潛在靶點

vBNST對不可預測威脅反應的神經元群活動發生改變的分子機製尚不清楚。因此，作者采用磷酸化翻譯核糖體親和純化（pTRAP）技藝結合RNA測序，以鑒定vBNST對不可預測威脅反應的關鍵分子。作者通過qPCR驗證了vBNST神經元中鉀通道表達的下調，其中KCNQ3 mRNA的表達下調最為顯著（圖6D）。免疫荧光染色證實，與CS⁺測試相比，vBNST中GABA能神經元的KCNQ3表達在CS⁻測試中更低（圖6E和6F）。

隨後，通過Western blot實驗研究了慢性不可預測應激（CUS）處理與KCNQ3表達之間的關系。CUS處理後KCNQ3蛋白和mRNA水平的下降（圖6G-6I）。vBNST中CS⁻反應性神經元的內在興奮性增加，且在腦片膜片鉗記錄中M型電流降低（圖7A-7E）。在CUS處理後，小鼠在家庭籠中vBNST中CS⁻反應性神經元的活動增加被抑製，導致在vBNST中CS⁻反應性神經元中過表達KCNQ3後焦慮樣行為的相應減少（圖7F-7K）。將KCNQ家族通道的激動劑瑞替加濱註入vBNST可以減輕CUS處理後觀察到的電生理和行為改變，以及不可預測應激後vBNST中CS⁻反應性神經元群的過度活躍和焦慮行為（圖S12）。

圖6. 在CS⁻測試和CUS處理後，KCNQ3水平的降低被識別出來

結論

作者的研究闡明了調控不可預測威脅誘導焦慮的協同興奮性和抑製性神經環路。vBNST中特定的GABA能神經元作為不可預測威脅信息匯聚和焦慮誘導的核心，而KCNQ通道在神經元興奮性中發揮重要作用。本研究對於理解不可預測威脅誘導焦慮的神經環路以及識別不可預測應激後焦慮癥治療的潛在分子靶點具有重要意義。

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